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牛奶黄曲霉毒素M1 液相色谱法精准检测方案

来源:绿洲生化  发布时间:2013-6-21 11:20:25  点击:1960

 针对近期奶中出现的黄曲霉毒素M1超标问题提出以下液相色谱法精准检测方案。

 
1. 仪器
 
1.1 高效液相色谱仪配荧光检测器
 
1.2震荡器(或高速搅拌器)
 
1.3 高速离心机
 
1.4 泵流操作架(带气泵)
 
2. 试剂与试液
 
2.1 色谱甲醇
 
2.2 蒸馏水
 
2.3 乙腈+水(25+75)
 
2.4 石油醚
 
2.5 10%乙腈
 
2.6 氢氧化钠溶液(0.5mol/L)
 
玻璃纤维滤纸(PriboFast免疫亲和柱免费赠送)
 
 
3. 测定法
 
本法系用高效液相色谱法(GB/T 18980-2003)测定牛奶,奶粉等产品中的黄曲霉毒素M1,除另有规定外,按下列方法测定。
 
3.1 色谱条件
 
色谱柱:C18柱,150×4.6mm,5um
 
检测器:荧光检测器;激发波长365nm,发射波长435nm;
 
流动相:乙腈-水(25:75)
 
流速:1.0ml/min
 
进样量:20ul
 
柱温:室温
 
3.2  标准品溶液的配制
 
取黄曲霉毒素M1标准品,用乙腈稀释成0.5ug/ml的标准储备液。根据使用需要,准确吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黄曲霉毒素标准储备液,置5ml的容量瓶中,用流动相稀释至刻度,配成相当于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液,即得。
 
3.3  样品前处理
 
3.3.1牛奶
 
将100mL牛奶水浴加热至40℃;
 
4000r/min离心15min,收集50mL清澈液待用;
 
3.3.2乳粉和粉状婴幼儿配方食品
 
称取10g奶粉样品,将100mL50℃水多次少量加入,搅拌,使奶粉充分溶解;
 
6000r/min离心15min,收集50mL清澈液待用;
 
3.3.3发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)
 
称取60 g混匀的试样,用0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4;
 
用高速均质器在 9500 转/分钟,高速匀浆5 min
 
水浴加热至40℃;
 
4000r/min离心15min,收集50mL清澈液待用
 
3.3.4干酪
 
称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50 mL离心管中,加2 mL水和30 mL甲醇;
 
用高速均质器在 9500r/分钟,高速匀浆5 min;
 
超声提取30 min;
 
在6000r/分钟下离心15 min,收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。
 
在分液漏斗中加入30 mL石油醚,振摇2 min;
 
待分层后,将下层移于50 mL烧杯中,弃去石油醚层。
 
重复用石油醚提取2次;。
 
 
将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中,减压浓缩至约2 mL;
 
浓缩液倒入离心管中,烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤,洗涤液一并倒入50 mL离心管中;
 
加水稀释至约50 mL,在6000 转/分钟下离心 5 min,上清液供净化处理。
 
3.3.5奶油
 
称取5g试样,置于50 mL烧杯中;
 
用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。
 
加20 mL水和30 mL甲醇,振荡30 min后,将全部液体移于分液漏斗中;
 
待分层后,将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中,在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL,加水稀释至约50mL,供净化处理。
 
 
3.4供试品溶液的制备
 
3.4.1 PriboFast® 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的操作
 
将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取50.0mL净化溶液注入玻璃注射器;
 
将空气压力泵与注射器连接,调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2~3mL空气通过柱体;
 
更换10ml注射器与亲和柱连接,在注射器中加入10ml水,调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。
 
准确加入4mL色谱级乙腈洗脱,流速为1 mL/min~2mL/min,收集全部洗脱液于玻璃试管中,供检测用。(建议将乙腈的量分2-4次加入。每次加入后,要让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2分钟。洗脱后的乙腈溶液,最好是水浴30℃加热吹近干。用10%乙腈定容后上液相)
 
3.5 测定
 
精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液各20ul,注入液相色谱仪,测定峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。另精密量取供试品溶液20ul,注入液相色谱仪,测定峰面积,从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素M1的量,计算,即得。
 
1.本实验应有相应的安全、防护措施,并不得污染环境。
 
2.残留有黄曲霉毒素M1的废液或废渣的玻璃器皿,应置于专用贮存容器(装有10%氯酸钠溶液)内,浸泡24小时以上,再用清水将玻璃器皿冲洗干净。
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